含荧光开关的合成分子/蛋白质杂交探针用于DNA甲基化活细胞成像

堀江雄一郎、大村典道、西田绫子、西浦宫子、梅野真浩、须武Isao、菊池一也。j。化学。Soc。140，5, 1686 - 1690。

DOI:http://10.1021/jacs.7b09713

摘要

由合成分子和蛋白质组成的混合探针是检测活细胞中生物分子和信号的有力工具。到目前为止，混合探针的大多数目标仅限于pH值和小的分析物。尽管生物大分子对细胞的生理功能至关重要，但基于杂交探针的方法很少用于生物大分子的活细胞检测。在这里，我们开发了一种带有化学开关的混合探针，用于甲基化DNA的活细胞成像，甲基化DNA是抑制基因表达的重要大分子。利用蛋白质标记技术，我们创建了一个混合探针，包含一个dna结合的荧光素和一个甲基化的dna结合结构域。该杂交探针与甲基化DNA结合后荧光强度增强，并在有丝分裂过程中成功监测甲基化DNA。这种杂交探针具有小分子或荧光蛋白探针所没有的显著优势，可用于活细胞分析与DNA甲基化相关的表观遗传现象和疾病。

介绍

利用合成分子/蛋白质探针检测活细胞中的各种生物分子和信号已成为当前生物成像的一种优势方法。^［1］尽管生物大分子对细胞的稳态和功能至关重要，但是很少有关于生物大分子活细胞检测杂交探针的研究报道。
在这篇文章中,教授k .菊池和他们的同事开发了一种用于生物大分子成像的混合探针，专注于表观遗传修饰的DNA。为了对甲基化的DNA进行荧光检测，他们设计了一种混合探针，由DNA结合的荧光剂和pyp3r标记的MBD组成_75年−1(PYP3R-MBD_75年−1)。基于他们之前的研究，^[２]他们首先从基因上表达了MBD1衍生的MBD1−75，用于特异性识别甲基化DNA的模块。对于检测甲基化DNA的荧光素，他们设计了pyp配体共轭恶唑黄^［3］(YOCNB)，并在活细胞中生成杂交探针。(图1)

图1显示了使用py -tag标记系统创建的杂交探针对甲基化DNA进行荧光检测的原理。

细节

图2显示了混合探针与甲基化DNA的选择性结合。混合探针代表了PYP3R-MBD复合物_{1 - 75}和YOCNB。(a) PYP3R (5 μM)或(b) PYP3R- mbd反应后_{1 - 75}(5 μM)与YOCNB (5 μM)配合物(0,50,100,200,300和400 nM)与甲基化或未甲基化DNA (50 nM)孵育，然后用凝胶位移法分析。

图3显示了使用混合探针对甲基化DNA的荧光检测。混合探针(400 nM)和YOCNB (400 nM)在DNA (50 nM)缺失或存在时的荧光光谱，DNA (50 nM)被甲基化或未甲基化。

图4显示甲基化DNA的活细胞成像。(a)空质粒和编码PYP3R-MBD质粒转染细胞的荧光图像_{1 - 112}或PYP3R。加入YOCNB (2 μM)、Hoechst 33342 (300 ng/mL)和MitoTracker Deep Red (2 μM)。杂交探针Hoechst 33342的荧光颜色及其共定位在图像中分别显示为绿色、品红和白色。比例尺，20 μm。(b) 5-AzadC对细胞核荧光的影响。PYP3R-MBD_{1 - 112}-表达细胞在无或无5-AzadC (25 μM)的情况下预处理24 h，然后与YOCNB (2 μM)孵育75分钟。(c)基于成像的甲基化DNA定量分析。细胞表达PYP3R-MBD_{1 - 112}用不同浓度的5-AzadC孵育24 h，然后用YOCNB (2 μM)标记。YOCNB在细胞核中的归一化荧光强度与5-AzadC浓度相对应。

图5显示了有丝分裂过程中甲基化DNA的延时成像。用pyp3r - mbd1 - 112编码质粒转染稳定表达mCherry-hGem1-110的细胞，用YOCNB (2 μM)孵育40分钟，荧光显微镜获得延时图像。比例尺，5 μm。

参考