用于多采集受激发射耗尽成像的超光稳定性磷酸孔染料gydF4y2Ba

晨光Wang Masayasu塔基•Yoshikatsu佐藤,爱子Fukazawa, Tetsuya这个,Shigehiro山口。gydF4y2Baj。化学。Soc。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba, 139,gydF4y2Ba10374 - 10381。gydF4y2Ba

DOI:gydF4y2Bahttp://10.1021/jacs.7b04418gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

由于受激发射耗尽(STED)显微镜能够提供超越衍射极限的光学分辨率的细胞结构细节，已成为细胞生物学中不可或缺的工具。然而，强烈的STED激光束通常会导致所使用的荧光染料的快速光漂白，这极大地限制了STED显微镜在实际应用中的应用。本文报道了一种新型的超光稳定染料PhoxBright 430 (PB430)，它由一个完全环融合的π共轭骨架和一个接受电子的磷孔组成gydF4y2BaPgydF4y2Ba氧化单元。我们之前开发了一种超光稳定性染料C-Naphox，通过将磷孔单元与供电子三苯胺部分结合。在PB430中，氨基的去除使其转变类型由分子内电荷转移性质转变手机金沙网址为π -π *转变性质，从而产生对分子环境不敏感的强荧光，荧光颜色和强度不受分子环境的影响，即使在水溶液中也会产生明亮的荧光。PB430在水中的溶解度高，能够标记蛋白质，保持高荧光量子产率。这种染料即使在STED条件下也表现出出色的抗光辐照性，并允许连续采集STED图像。事实上，使用pb430标记的抗体，我们成功地获得了超分辨率STED图像的三维重建，以及基于光稳定性的荧光标记细胞骨架结构的多色STED成像。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

荧光纳米显微镜，特别是STED显微镜，越来越多地用于生物样品的可视化，也用于各种物理和化学过程的检查。gydF4y2Ba^[1]gydF4y2Ba然而，从实际的角度来看，必须使用具有极高功率(>10 MW/cm2)的环形耗尽激光束(STED激光器)来辐照样品，这严重限制了STED显微镜的应用。尽管已经做了许多努力来提高染料的耐光性，但对STED的高耐光性荧光染料的问世仍有很高的需求。在这篇文章中,gydF4y2Ba美国教授山口gydF4y2Ba名古屋大学的报告gydF4y2Ba第二代超光稳定荧光染料PhoxBright 430的设计，gydF4y2Ba^{[２]gydF4y2Ba}PB430表示。PB430显著地扩展了这种荧光染料在STED纳米镜中的实际应用。gydF4y2Ba

细节gydF4y2Ba

图1是基于第一代超耐光染料C-Naphox的合理结构修饰后的PB430分子设计。gydF4y2Ba

图2显示了(a) c -萘酚(b)的归一化吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba, (c)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在甲苯(蓝线)和CH中gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCN(橙色线)。gydF4y2Ba

图3显示了PB430在PBS缓冲液(pH 7.4)中的(a)吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)，以及(b) Alexa Fluor 488、C-Naphox和PB430的光稳定性比较。DMSO/HEPES缓冲溶液(pH = 7.3, v/v = 7/3)对Alexa Fluor 488(蓝色三角形)、C-Naphox(绿色方块)和PB430(橙色圆圈)的吸收变化绘制成Xe灯(9 mW cm)照射时间的函数gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)配有460±11 nm的带通滤波器。调整溶液浓度，使其在460 nm处的光密度具有可比性。gydF4y2Ba

图4显示了固定HeLa细胞中免疫标记微管的荧光图像:(a)共聚焦(左)和STED(中)显微镜图像和强度分布图(右)以及共聚焦(黑线)和STED(绿线)图像插图中的虚线。(b, c)前5张用(b) PB430和(c) Alexa Fluor 488染色的STED显微镜图像。(d)综合荧光强度绘制成记录的STED图像数量的函数。所有图像记录在470 nm激励下，使用592 nm耗尽激光(CW-STED, 30 mW)进行STED。比例尺表示2 μm。gydF4y2Ba

图5显示了(a) PB430免疫标记的HeLa细胞微管的三维STED图像，包括与高度(增量为gydF4y2BazgydF4y2Ba方向,50 nm;比例尺，5 μm)。在以下STED条件下记录图像:激发470nm (WLL, 5 μW)，耗尽592 nm (CW-STED, 30 mW;、3 dgydF4y2BazgydF4y2Ba甜甜圈，50%)，门控检测在gydF4y2BatgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba= 0.5 ns。使用惠更斯反褶积软件(信噪比7;质量阈值，0.05)gydF4y2BazgydF4y2Ba-切片图像被着色以表示gydF4y2BazgydF4y2Ba深度。(b)沿对应方向的STED图像gydF4y2BaxzgydF4y2Ba和gydF4y2BayzgydF4y2Ba面板a中的飞机。gydF4y2Ba

参考gydF4y2Ba

[1]”gydF4y2BaSTED显微镜显示Synaptotagmin在突触囊胞胞出后仍然聚集gydF4y2Ba”。gydF4y2Ba

DOI:gydF4y2Ba10.1038 / nature04592gydF4y2Ba

[2]“一种特殊耐光漂白的氧化磷基荧光染料:STED显微镜连续成像的实用工具”gydF4y2Ba

DOI:gydF4y2Ba10.1002 / anie.201507939gydF4y2Ba